文章信息miR-100-5p-abundant exosomes derived from infrapatellar fat pad MSCs protect articular cartilage and ameliorate gait abnormalities via inhibition of mTOR in
osteoarthritis
Jiangyi Wu, Liang Kuang, Cheng Chen, Junjun Yang, Wei-Nan Zeng, Tao Li, Hao Chen, Shu Huang, Zhenlan Fu, Jiamiao Li, Renfeng Liu, Zhenhong Ni, Lin Chen, Liu
Yang
DOI: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.03.022
Biomaterials (IF=8.806)
研究背景我们研究了髌下脂肪垫（IPFP）间充质干细胞（MSCs）的外泌体（MSCIPFP -Exos）在体外和体内对骨关节炎（OA）的作用和潜在机制。结果揭示一种治疗OA的新策略。
方法从关节病患者细胞分离外泌体，WB鉴定外泌体。对小鼠进行关节炎诱导，制备样品，进行组织学分析，免疫组化分析，蛋白印迹分析，绿色荧光蛋白分析，PCR定量分析，双荧光素酶报告基因测定，qPCR定量分析（wcgene biotech，Shanghai，上海启因生物 ），miRNA文库构建和测序，以及小鼠步态分析，最后对数据进行综合分析。
结果1.MSCsIPFP和MSCIPFP的分离与鉴定，结果说明人类髌下脂肪垫来源的MSCs可以产生大量的外泌体样小泡。
图1. （A）MSCsIPFP的分离流程图。 （B）MSCsIPFP显示出代表性的纺锤状形态。（C）MSCsIPFP 上细胞表面标志物的流式细胞术分析，蓝线代表同种型对照，红线代表测量的表面标志物。（D）MSCIPFP-Exos的分离示意图。（E）通过透射电子显微镜（TEM）观察到的MSCIPFP 8 -Exo的形态。（F）通过Nanosight测量的MSCsIPFP-Exos的粒度分布。（G）使用蛋白质印迹测量的MSCsIPFP-Exos和MSCsIPFP的表面标志物。（H）MSCsIPFP-Exos的流式细胞术成像。
2.MSCIPFP-外泌体能显著预防DMM小鼠软骨破坏，部分改善其步态异常。
图2.（A）关节内注射方案。（B）代表膝关节中DiO标记的MSCsIPFP -Exos。黄色箭头表示MSCsIPFP -Exos，虚线表示关节表面。（C）关节内注射的设计。（D）Safranin O / Fast Green和H＆E染色的膝关节部分。（E）用OARSI评分系统评估软骨破坏。（F）和（G）膝关节胫骨平台切片中胶原蛋白II，ADAMTS5和MMP13的免疫组织化学分析。（H）Catwalk测试的流程图。（I）Catwalk脚印的代表性信号图像。（J-M）组间比较的步态参数的水平变化。
3.MSCIPFP 449 -Exos抑制细胞凋亡并促进IL-1β诱导的软骨细胞合成代谢。
图3. （A）软骨细胞和MSCIPFP11-Exos共培养的模式。（B）由软骨细胞吸收的DiO标记的外泌体的代表性共聚焦显微照片。（C）MSCIPFP -Exos对软骨细胞活力的影响。（D）和（E）通过流式细胞术检测MSCIPFP -Exos对细胞凋亡的影响的结果并统计分析。（F）通过蛋白质印迹测量软骨细胞中胶原蛋白II，MMP13和ADAMTS5的蛋白质表达水平。（G）和（H）通过免疫荧光检测软骨细胞中的胶原蛋白II，ADAMTS5和MMP13表达及统计结果。
4. MSCIPFP -Exos通过抑制mTOR信号传导途径增强自噬水平
图4. （A）通过蛋白质印迹检测自噬相关蛋白表达。（B）和（C）三次独立实验的统计分析结果。（D）使用透射电子显微镜观察软骨细胞中的自噬体。（E）自噬体数量的定量分析。（F）使用荧光显微镜观察绿色荧光GFP-LC3斑点。（G）GFP-LC3斑点的统计分析。（H）通过蛋白质印迹检查MMP13的表达。（I）三次独立实验的统计分析结果。（J）通过PCR ARRAY检测软骨细胞中45个自噬相关基因的相对表达水平（wcgene biotech shanghai）。（K）通过qRT-PCR测定mTOR mRNA的表达。（L）和（M）通过蛋白质印迹测试P-mTOR的表达，并显示三个独立实验的统计分析。（N-P）通过蛋白质印迹检测P-mTOR和P-p70S6K的表达，并显示三个独立实验的统计学分析。
5. MSCIPFP-exos中的miR-100-5p介导mTOR的下调表达
图5. （A）生物信息学分析预测mTOR和miR-100-5p之间的潜在结合序列。（B）miRNA在总miRNA读数中的相对比例。（C）表示mTOR mRNA的3'UTR中mir-100-5p的预测结合位点和突变型mTOR 3'UTR（mTOR 3'UTR-mu）的示意图。（D）使用双荧光素酶报告系统测定荧光素酶活性。（E）软骨细胞用软骨细胞MSCIPFP -Exos 培养24h，然后通过qRT-PCR检测mir-100-5p的相对表达。（F）通过蛋白质印迹检查P-mTOR的蛋白质水平。
6. 关节内注射antagomir-100-5p可破坏MSCIPFP-Exos对DMM模型中受损软骨的治疗作用
图6（A）显示关节内注射时间的流程图。（B）小鼠膝关节的染色。（C）DMM小鼠膝关节的OARSI评分。（D）和（E）膝关节胫骨平台切片中胶原蛋白II和MMP13的免疫组织化学分析。
7.在DMM模型中Antagomir-100-5p部分逆转MSCIPFP-Exos调节的mTOR信号。
图7. （A）和（B）膝关节胫骨平台切片中P62，LC3B和mTOR的免疫组织化学分析。（C）软骨保护中MSCIPFP -Exos的潜在机制。
结果总结本研究表明，MSCIPFP外泌体可以通过抑制软骨细胞凋亡，平衡合成代谢和分解代谢过程来保护软骨免受损伤，并改善DMM诱导的OA小鼠的步态模式。 该机制可能与miR100-5p介导的mTOR-自噬途径的抑制有关。 由于临床关节镜手术从OA患者获取人IPFP相对方便可行，我们的研究结果可能为使用MSCIPFP -Exos治疗骨性关节炎提供新的潜在治疗策略。
