文章标题：

Unexpected patterns of Epstein–Barr virus transcription revealed by a High throughput PCR array for absolute quantification of viral mRNA

Rosemary J Tierney， Claire D Shannon-Lowe， Leah Fitzsimmons， Andrew I Bell，Martin Rowe

杂志：Virology

DOI：https://doi.org/10.1016/j.virol.2014.10.030

研究背景：

通过RT-QPCR芯片平台的绝对定量检测不同潜伏期和溶解感染状态的Epstein-Barr病毒转录本，并获得新发现。

方法

对培养的细胞进行诱导和转染Epstein-Barr病毒，通过PCR芯片绝对定量方法，检验不同时间点的mRNA变化。

结果

利用48:48Fluidigm芯片RT-QPCR验证EBV转录本

从10个独立实验获得的相同6个代表性基因的Ct值的比较证明，Fluidigm Biomark HD系统的结果在4至5个对数范围内是可重复的（图1D）。

图1.（A）AQ质粒的设计。（B）热图总结了10倍稀释的AQ质粒与对照质粒的45个PCR测定的信号。（C）5份EBV转录本和PGK细胞转录本的典型标准曲线，包括潜伏转录本Wp；立即早期（IE）裂解转录本，BZLF1；早期（E）裂解转录本，BALF1；晚期（L）裂解转录本，BILF1；非编码转录本，EBER1；和细胞转录本，PGK1。（D）10个独立预扩增的AQ-质粒稀释液独立重复的结果证明，Fluidigm Biomark HD系统的结果在4至5个对数范围内是可重复的

诱导裂解周期后EBV转录本的绝对定量

在使用质粒对照验证了高通量绝对定量方法之后，接下来使用EBV分析组来表征从潜伏期转变为病毒复制后的EBV转录组。细胞诱导裂解循环，并且在0.5至72小时的间隔收获细胞用于RT-QPCR分析。

未经处理的Akata-BL细胞（0小时）的潜在基因转录水平非常低。诱导后2小时，BZLF转录本的数量明显增加，尽管第二个IE RNA BRLF1的水平低得多并且在整个时间过程中保持如此。BZLF1是诱导后4小时最丰富的转录本。在此时间点也检测到几种E RNA，其中BHRF1，BMLF1，BMRF1，BNLF2A和BNLF2B是最丰富的。除BNLF2A和BNLF2B外，E基因表达通常持续升高至诱导后12小时，然后下降。相比之下，L基因表达通常在诱导后24小时达到峰值。虽然LF1和LF2的水平在诱导后12小时达到峰值，与E基因表达一致，但LF3仅在24小时达到最大水平。

诱导后24小时潜伏基因转录增加也很明显，最明显的是LMP1，EBNA2和LMP2A（图2，图3）。最丰富的这些LMP1仍然比最丰富的裂解转录本BVRF2低约30倍。由于裂解循环Fp启动子的激活，EBNA1转录本在裂解循环诱导后也增加（图3）。编码EBNA1的UK-和FUK-剪接的转录本的水平仍然非常低，并且仅代表总Fp-起始转录的约10％（FU测定，图3）。

图2.在裂解周期诱导期间EBV转录本的绝对定量。个体潜伏，即刻早期（IE），早期（E），晚期（L）和非编码转录本的水平。

图3.裂解周期诱导期间EBV转录变化的动力学研究。

原发性B细胞感染期间EBV转录本的绝对定量

接下来更全面地表征和量化EBV驱动的体外原代静息B细胞转化过程中潜伏和裂解病毒转录本的绝对水平。分离CD19阳性B细胞并用MOI为100的2089重组EBV毒株感染，并在多个时间点收获细胞以分离RNA和定量病毒基因转录本。

感染后第1天，Wp启动的和EBNA2特异性转录本的水平已经超过60,000转录本/ ng RNA（图4A），其中还存在较低水平的Y2-HF剪接的潜在BHRF1转录本。这些Wp启动的EBNA2和BHRF1转录本的初始水平分别比感染后3个月内测试的3个早期传代LCL中的平均水平高约18倍和3倍（图4A和B）。Cp启动的EBNA转录本与UK-剪接的EBNA1和EBNA3A转录本一起在感染后第1天也可检测到，但是水平低得多（图4A）。

到感染后第2天，Wp活性和EBNA2转录水平开始下降，而Cp启动的转录物增加，LMP1现在可检测到。在剩余的时间过程中，Wp活性和EBNA2和BHRF1转录水平继续下降，而Cp启动的转录物保持不变。到第5天，LMP1水平达到最大值，EBER1 RNA变得可检测到。感染后10天，除EBER外，转录谱与已建立的LCL相似（图4A和B）。即使在Wp活性在稍后的时间点下降后，Wp启动的转录物的数量仍然与Cp转录物的数量相当。

与潜在基因转录相反，在初次感染期间存在非常少的裂解周期转录物（图4A，5）。值得注意的例外是BNLF2A和BNLF2B，其与LMP1同时检测到，并且与LMP1等同（图4A和5）。在其他可检测的裂解周期转录物中，最丰富的是BZLF1，其在感染后5天达到峰值（图4A）。然而，该BZLF1信号至少比真正裂解循环期间观察到的水平低100倍（参见图2和4A），这意味着小于0.5％的细胞表达高水平的BZLF1或BZLF1在整个表达水平均很低。

图4.在正常B细胞感染期间诱导的EBV转录本的绝对定量。（A）从外周血分离的原代B细胞在M.O.I.感染。（B）平行测定3个新建立的LCL（感染后2-3个月）。

图5.热图比较裂解周期诱导期间和原代B细胞感染期间的EBV转录本水平。数据表示为相对于PGK转录本的EBV转录本的数目。

感染性病毒体内的EBV mRNA

通过密度梯度离心纯化的病毒制剂中存在的RNA转录物和EBV DNA基因组的数量（表1）。研究结果表明，传入的病毒可以提供无关紧要的病毒转录本。

表1.在成熟感染性病毒体中检测到EBV mRNA

不同形式潜伏期的EBV病毒转录本定量

接下来，我们比较了8个Lat I BL系列，5个Wp限制BL系列，5个Lat III BL系列和10个Lat III LCL系列中EBV转录本的绝对水平。

图6.(A)从3条显示不同形式潜伏期的具有代表性的BL线和从Oku BL分离出的EBV株感染正常B细胞所建立的LCL中获得芯片数据。(B)从8个Lat I BL线，5个Wp BL线，5个Lat III BL线和10个LCL获得的数据的热图。

BL活组织检查样本中EBV转录本的定量

图7.（A）从5个BL活组织检查样品中获得的芯片数据。（B）从所有7个BL活组织检查获得的芯片数据的热图汇总。

结果总结

首先，在感染正常B细胞期间，Wp启动的潜在基因转录物在Cp启动子激活后比目前所怀疑的更加丰富。其次，EBNA1转录水平在所有形式的潜伏期中都非常低，通常为每个细胞1到10个转录物。EBNA3A，-3B和-3C转录物在潜伏期III中同样非常低，通常在与EBNA1转录物相似或更低的水平。第三，裂解基因转录物的子集在Burkitt淋巴瘤细胞系中可检测到低水平，包括：具有致癌特性的BILF1，以及表征不佳的LF1，LF2和LF3基因。对7个非洲BL活组织检查的分析证实了该转录谱，但另外揭示了LMP2转录物的显着表达。