A rapid method of preparing complex organohalogen extracts from avian eggs: Applications to in vitro toxicogenomics screening

Doug Crump, Kim L. Williams, Suzanne Chiu, Luke Periard, Robert J. Letcher

DOI: 10.1002/etc.4364

研究背景

从含有不同浓度的有机卤素污染物（OHCs）的双冠鸬鹚（DCCO）蛋中收集和制备环境相关的提取物，使用体外生物测定法表征潜在影响。

 

研究方法

1. 从5个不同地点——大湖区：1）泥岛（MUD）；2）中姊妹岛（MSI）；3）汉密尔顿港（HAM）；4）斯特拉坎岛（STR）；非大湖地区：曼达特岛（Man）收集DCCO卵。

2. 用脂质冷冻 - 过滤提取方法来制备从具有可变OHC负荷的五组DCCO卵的提取物。

3. 分析五组样品264种OHC，包括：207个多氯联苯（PCB）同系物，18种多氯二苯并对二恶英（PCDDs）和二苯并呋喃（PCDFs），30种有机氯农药（OC）和9种多溴二苯醚（PBDE）同类物。

4. 将溶解在DMSO中的提取物施用于鸡胚胎肝细胞（CEH）。

5. 使用鸡ToxChip PCR芯片检测对细胞活力，7-乙氧基脱嘌呤-O-脱乙酰酶（EROD）活性和mRNA表达的影响

结果

1 DCCO蛋提取物的化学分析

5组样品具有不同的ohc浓度，具有较大OHC负荷的提取物，EROD EC 50值较低。MSI浓度最高，而非大湖区MAN浓度最低。在所有五个菌落中，化学类别的浓度等级顺序如下：

ΣPCBs - MSI> MUD> HAM> STR >> MAN; ΣOCs - MSI> MUD> HAM> STR> MAN; ΣPBDEs - MSI≈HAM> MUD> STR> MAN; 和ΣPCDD/ F TCDD毒性当量（TEQs）-MSI>HAM≈STR≈MUD> MAN。

2.双冠鸬鹚卵提取物对细胞活力和EROD活性的影响

双冠鸬鹚卵提取物在CEH中以浓度依赖性方式诱导EROD活性，随后在较高提取物稀释度下降低（图1）。我们实验室曾报道在较高施用浓度的AhR激动剂下EROD活性降低，与诱导物对反应的竞争性抑制有关。EROD EC 50值的提取物稀释 - 从MAN的0.172到HAM的0.003 - 表明这种敏感的生化分析可以从AhR活性的角度区分DCCO提取物（图1）。受污染最严重的3个地点 ： MSI，MUD和HAM具有相似的EROD EC50值（0.003-0.007），而较少污染的地点（STR和MAN）具有较高的值（图1）。

图1.双冠鸬鹚卵提取物对鸡胚肝细胞中7-乙氧基脱嘌呤-O-脱乙酰酶（EROD）活性的浓度依赖性影响。

3禽类ToxChip PCR 芯片

图2显示非大湖地区（MAN）DCCO卵提取物对CEH的影响与其他四组大湖地区的DCCO卵提取物对CEH的影响有明显差异。各组样品中最显著的基因是Cyp1a4。cyp1a4的转录组学评价与erod分析的结果一致，后者测量cyp1a4酶的诱导，并被广泛用作野生动物暴露于与AHR结合的物质的生物标志物。cyp1a4 mRNA诱导的变异性也一致。说明可以使用高通量分析来评估二恶英类（DLC）污染物对不同地点的野生动物的潜在影响。

同样，CEH中的其他差异靶基因包括thrsp、txn、alas1、scd和lbfabp，也有助于研究污染物负担变化。

图2.热图显示鸡胚肝细胞（CEH）给药后由靶基因和双冠鸬鹚群聚类的第5代鸡毒性PCR芯片的基因显着倍数变化。红色和绿色分别表示上调和下调。

结果总结

从环境相关的生物基质（如野生动物组织）的提取物中快速制备复杂化学组分的方法可以确定实际的暴露场景，并通过体外分析确定影响。禽蛋是一种测定复杂混合物效应的有效的生物监测工具，结合快速提取方法、体外生物测定和靶向终点评价（如生化和转录组学）在环境效应监测有巨大前景。