文章信息：

Use of high-throughput RT-qPCR to assess modulations of gene expression profiles related to genomic stability and interactions by cadmium

Bettina Maria Fischer, Daniel Neumann, Ann Liza Piberger, Sarah Fremgaard Risnes, Beate Köberle, Andrea Hartwig

Archives of Toxicology.

November 2016, Volume 90, Issue 11, pp 2745–2761

研究背景:

通过高通量RT-qPCR分析重金属对细胞影响，了解化学致癌物作用模式。实验结果表明高通量RT-qPCR可成为毒理学风险评估的有效工具。

方法

通过Fluidigm实时PCR对镉处理的腺癌A549和上皮支气管BEAS-2B细胞进行基因表达分析。高通量RT-qPCR分析了96个样本中对维持基因组稳定性至关重要的95个基因，包括应激反应和DNA修复，细胞周期控制，细胞凋亡和有丝分裂信号。用GenEx软件处理数据。

结果

通过比较癌症和非癌细胞系之间对基因表达的影响，鉴定了与其转化状态相关的明显差异。揭示了不同的剂量和时间依赖性以及细胞类型特异性基因表达模式，包括诱导编码金属硫蛋白的基因，氧化应激反应，细胞周期控制，有丝分裂信号传导和细胞凋亡。虽然诱导了编码DNA损伤反应的基因，但不同的DNA修复基因在转录水平上被下调。因此，该方法全面概述了镉与不同信号通路的相互作用，也反映了镉诱导致癌性的分子作用模式。

1.PCR法特异性和性能的测定

图1评估引物特异性。 a.具有相应大小的特定靶扩增子的基因NFκB，OGG1，PMAIP1，PRDX1和RRM2B的琼脂糖凝胶电泳分析。b.OGG1，PMAIP1和RRM2B的熔解曲线，及其相应的解链温度。

图2引物效率的性能。 对a.GAPDH，b. JUN和c .SIRT2进行扩增曲线校准。标准cDNA的六个连续稀释液（1-200倍）。 校准曲线图（x轴log10，y轴C q值）具有线性回归趋势线和d .GAPDH，e. JUN和f. SIRT2的相关系数。 可以从校准曲线的斜率计算引物效率。

2.     镉对基因表达谱的影响

对氧化应激反应相关基因的影响

图3镉对与摄取和氧化应激反应相关的基因表达的影响。 将BEAS-2B细胞（a）或A549细胞（b）用CdCl 2处理24小时。

图4镉对抗氧化防御系统相关基因表达的影响。 BEAS-2B细胞用CdCl2处理8或24小时。

对与细胞周期调节和增殖相关的基因的影响

镉诱导生长促进和细胞周期调节基因，然而在不同时间点产生不同的模式。

图5.镉对细胞周期调控和增殖相关基因表达的影响。 BEAS-2B细胞用CdCl2处理8或24小时。

对凋亡相关基因的影响

镉通过调节编码内源级联因子的重要基因显示促凋亡信号传导。 在BEAS-2B和A549细胞中，编码促凋亡蛋白NOXA的基因PMAIP1都被诱导转录。 然而，两种细胞系中诱导强度不同。

图6.镉对细胞凋亡相关基因表达的影响。 将BEAS-2B细胞（a）或A549细胞（b）用CdCl 2处理8或24小时。

对DNA损伤反应和修复相关基因的影响

关于DNA损伤和DNA修复的基因，损伤基因DDIT3和GADD45A的转录水平高度升高，在24小时处理后，在BEAS-2B细胞中观察到更明显的作用。

图7.镉对DNA损伤反应相关基因表达的影响。 将BEAS-2B细胞（a）或A549细胞（b）用CdCl 2处理8或24小时。

图8.镉对DNA修复系统相关基因表达的影响。 将BEAS-2B细胞（a）或A549细胞（b）用CdCl 2处理8或24小时。

结论

高通量RT-qPCR有助于预测研究不足的物质的作用模式，可作为进一步研究蛋白质水平的基础，为深入研究感兴趣物质的分子相互作用提供全面的基础。高通量RT-qPCR是一种有前景的毒理学风险评估工具。